Nel metabolismo energetico le cellule producono notevoli quantità di CO2
che deve essere eliminata con l’apparato respiratorio. Il
trasferimento della CO2 dalle cellule al sangue e da
esso allo spazio alveolare avviene previa
idratazione del diossido di carbonio. Questo processo è spontaneo ma
avverrebbe in tempi lentissimi, non fisiologici.
Questa semplice reazione è catalizzata, nel nostro organismo, da un enzima
altamente specifico ed efficiente, l’anidrasi
carbonica. Una sola molecola può idratare 105 molecole di CO2al secondo e la reazione è 10 milioni di volte
più veloce di quella senza enzima! Solo grazie alla presenza
di enzimi le trasformazioni chimiche del nostro
organismo possono avvenire nei tempi e nei modi compatibili con le necessità
vitali.
Gli enzimi sono
proteinealtamente specializzate con una
funzione di catalisi estremamente specifica.
Tutte le catene o i cicli metabolici sono costituiti da una serie di
passaggi e di trasformazioni, anche minime, catalizzate da sistemi
multienzimatici.
Molti enzimi effettuano la loro azione
solo con i residui aminoacidici di aminoacidi posti nel sito attivo
e, in questo caso, sono proteine pure. Altri, invece, per la loro azione
catalitica, necessitano della presenza di
componenti chimici addizionali, cofattori, che possono essere ioni
inorganici come il Fe2+, il Mg2+, il Mn2+,
o lo Zn2+, oppure complesse molecole organiche chiamate
coenzimi. Sia i cofattori che i coenzimi sono
chiamati gruppi prostetici.
L’azione degli enzimi è caratterizzata da alcune proprietà fondamentali:
1) possono
accelerare le reazioni anche più di un milione di volte
2) escono
immodificati e di nuovo efficienti alla fine della catalisi.
3) sono
efficaci in piccole quantità.
4) non
influenzano l’equilibrio chimico di una reazione reversibile. Essi rendono
più veloce il processo in entrambe le direzioni.
L’equilibrio chimico viene semplicemente
raggiunto prima.
5) sono,
in genere, altamente specifici. Taluni hanno una specificità assoluta
Importanza dei
cofattori
I cofattori sono i
coenzimi, molecole organiche estremamente importanti per la
funzione degli enzimi, in genere vitamine idrosolubili oppure gli ioni
metallici che in genere operano sulla struttura enzimatica permettendole
di combinarsi col substrato.
Se il coenzima è legato
covalentemente alla proteina si parla di oloenzima, enzima
biologicamente attivo.
La proteina prende il
nome di apoenzima.
I coenzimi sono pochi e
li ritroviamo, sempre gli stessi, in numerosi enzimi.
Essi si consumano nelle
reazioni enzimatiche e vengono rigenerati in altre reazioni che avvengono in
compartimenti cellulari diversi
Meccanismo d’azione degli enzimi
La reazione di catalisi
enzimatica avviene all’interno di una “tasca” della proteina chiamata
sito attivo.
La molecola che si lega
all’enzima e su cui l’enzima opera si chiama substrato.
Gli enzimi, fondamentalmente,
stabilizzano lo “stato di transizione (ES)” che è la specie molecolare a
maggior contenuto energetico.
Si usa indicare con S il
substrato su cui l’enzima opera la trasformazione (catalisi) ed E l’enzima.
Tutto il meccanismo parte dalla formazione del complesso enzima-substrato ES
ed avviene secondo lo schema:
E + S ES EP
E + P
dove
ES è il complesso enzima-substrato ed EP il complesso enzima-substrato
modificato, ovvero il prodotto P. La reazione è reversibile. Come si
vede l’enzima esce immodificato dalla reazione e il substrato ha invece
subito la trasformazione operata dall’enzima ed è il prodotto della
catalisi.
Una reazione chimica
spontanea avviene dopo che si è superata una
barriera energetica, energia di attivazione, necessaria per favorire
l’allineamento degli orbitali di legame e gli urti tra i reagenti. Tali
urti, proporzionali alla concentrazione dei reagenti sono definiti urti utili. La velocità con cui questa reazione avviene dipende dal
movimento casuale delle molecole che è
proporzionale alla temperatura.
Gli enzimi catalizzano le reazioni abbassando l’energia
di attivazione
Nelle reazioni spontanee il
contenuto d’energia libera dei reagenti (substrato in questo caso) è
maggiore di quella del prodotto.
Nella figura A si vede
l'andamento di una reazione esoergonica (spontanea) non catalizzata. Il
picco massimo è l'energia d'attivazione che occorre superare affinché la
reazione proceda.
La figura B mostra
l’andamento della reazione catalizzata in cui si può osservare come lo stato
di transizione sia ad un livello di energia molto più bassa.
Abbassando l’energia d’attivazione, si avranno un numero superiore
di molecole in grado di superarla senza ricorrere ad aumenti di temperatura.
Nel grafico (B) si possono osservare le tappe descritte e gli stati
di transizione che corrispondono ai punti di maggior impegno energetico, in cui è possibile il ritorno verso i reagenti. Per questo sono i
momenti più critici della reazione.
I complessi ES ed EP invece sono i momenti di maggiore stabilità
energetica. Superato l’ultimo stato di transizione la reazione libera il
prodotto (substrato modificato) e l’enzima esce immodificato pronto per una
nuova catalisi.
L’azione dell’enzima è quindi quella di abbassare l’energia di
attivazione in modo selettivo “costringendo” i reagenti ad avvicinarsi,
orientarne gli atomi in modo che si possano formare o rompere i legami.
Gli enzimi sono proteine globulari complesse nella cui struttura terziaria
si può individuare una zona specifica, chiamata sito attivo, in cui
avviene la reazione col substrato e la sua trasformazione nel prodotto
specifico.
Il meccanismo d’azione dell’enzima è spesso paragonato a quello della
chiave-serratura per evidenziarne la specificità. In termini molecolari è
chiaro che esistono delle zone in cui, in modo altamente specifico, si
possono formare legami tra la residui aminoacidici della proteina enzimatica
e il substrato. Non raramente il sito attivo dell’enzima è la zona nella
quale è presente il gruppo prostetico la cui funzione è sempre di primaria
importanza nella catalisi.
Il modello chiave-serratura per esemplificare l’azione di un enzima è
largamente intuitivo ma anche decisamente insufficiente per comprendere il
delicato processo di legame di un enzima con il suo substrato, la catalisi e
la liberazione del prodotto.
Ci possiamo chiedere come è possibile questo enorme aumento
della velocità indotto dagli enzimi. e da dove arriva l'energia necessaria
ad abbassare l'energia d'attivazione di una reazione?
I gruppi funzionali nel sito attivo (residui aminoacidici, ioni
metallici, coenzimi) reagiscono col substrato generando una via della
reazione a bassa energia ricavata dalle numerose interazioni deboli non
covalenti, le stesse che stabilizzano le proteine: legami idrogeno, forze di
van Der Waals, interazioni idrofobiche ed ioniche. Queste interazioni,
esoergoniche, sono fondamentali per la formazione del complesso ES e ne
determinano la stabilità La somma di questo rilascio di piccole quantità di
energia, chiamata energia di legame, è la fonte
principale di energia libera necessaria per abbassare l'energia
d'attivazione. In definitiva, le interazioni deboli che portano alla
formazione del complesso ES sono le forze che contribuiscono alla catalisi.
Per avere la massima efficacia l'enzima dovrà avere solo una parziale
complementarietà al S ma dovrà essere totalmente complementare allo stato di
transizione ES.
Così anche la elevata specificità di un enzima, che è la
proprietà di distinguere molecole simili, si può spiegare con la
caratteristica disposizione dei gruppi funzionali nel sito attivo che se
formano interazioni perfette con un determinato substrato nello stato di
transizione, non potranno farlo con un substrato simile ma non identico. Da
un punto di vista strettamente molecolare il sito attivo si orienta in modo
tale da portare i gruppi specifici del sito attivo in condizioni di massima
efficienza per la catalisi. Questo adattamento porta ad una
modificazione conformazionale dell'enzima indotta da uno specifico
substrato.
Cinetica enzimatica
Lo
studio della velocità delle reazioni catalizzate da enzimi parte
considerando gli effetti della
[
S ], concentrazione del substrato che , naturalmente, varia nel corso della
reazione essendo S trasformato in P. Allora ponendo in vitro una [ S
]
molto superiore a quella dell'enzima si può calcolare la V0 ,
velocità iniziale, considerando la variazione di [ S ] trascurabile.
Il
grafico mostra l' effetto dell'aumento della concentrazione di substrato
sulla velocità iniziale di una reazione catalizzata da un enzima.
La
velocità aumenta esponenzialmente fino a raggiungere un plateau che
rappresenta la velocità massima che non varia anche con aggiunte successive
di substrato.
Questa velocità si raggiunge quando tutto l’enzima è saturato dal substrato.
La
velocità della reazione è data dall’equazione di Michaelis-Menten che lega
la velocità ad una costante , la Km,
caratteristica per ogni enzima e che è utile conoscere perché ci fornisce
una misura dell’affinità di un enzima per il suo suo substrato.
Vmax [S]
V0
=
——————
Km [S]
Poiché è difficile calcolare la velocità massima, ci conviene calcolare
1/2Vmax, sostituendo questo valore a V0.
2 Vmax [S]
da cui sostituendo: Km [S] =
—————— e quindi Km = [S]
quando V0
=1/2Vmax
Vmax
Dalla relazione si
evince che gli enzimi con una Km alta, hanno una minore affinità per il loro
substrato e viceversa.
L’esochinasi,
enzima presente nelle cellule del cervello, ha una Km di circa 400 volte più
piccola della glucochinasi che catalizza la stessa reazione nel
fegato: la fosforilazione del glucosio. Il motivo risiede nelle piccole
concentrazioni di glucosio presenti nel circolo encefalico e dalla
necessità che le cellule nervose hanno di utilizzarlo anche in basse
concentrazioni.
Gli
inibitori enzimatici
Gli enzimi, oltre a
catalizzare le reazioni, intervengono nei processi di regolazione
metabolica. Quindi saranno necessari meccanismi di attivazione o di
inibizione enzimatica.
Le sostanze che
inibiscono gli enzimi sono potenti agenti farmacologici. Per esempio
l'aspirina inibisce il primo enzima della sintesi delle prostaglandine
che partecipano al processo della produzione del dolore.
La regolazione
enzimatica
È chiaro che in un
organismo le vie metaboliche debbano funzionare con una coordinazione tale
che siano attive solo quelle necessarie al momento e inibite quelle che non
servono, in quel momento, alla vita di una cellula.
Vi sono enzimi
particolari che operano nella catena metabolica, attivandola o inibendola
secondo la richiesta e la concentrazione ottimale del prodotto finale che
concorrono a produrre.
A sua volta questo
importante enzima chiamato enzima regolatore, è controllato
dall’organismo attraverso vari sistemi come la stimolazione o l’inibizione a
produrre quel determinato enzima mediante ormoni o neurotrasmettitori.
L’enzima regolatore
determina quindi la velocità complessiva di una catena metabolica.
Nelle vie metaboliche vi
sono due classi di enzimi regolatori: gli enzimi allosterici che
agiscono mediante un legame reversibile di un metabolita regolatore chiamato
modulatore o effettore e gli enzimi regolati mediante
modificazioni covalenti reversibili.
Gli enzimi allosterici
Gli enzimi
allosterici hanno quasi sempre una struttura quaternaria (più subunità
polipeptidiche) e possiedono, oltre al sito attivo in una subunità,
anche un altro sito, sito regolatore in un'altra subunità, al quale
si lega l’effettore (o modulatore).
L’enzima esiste in due
configurazioni tra loro convertibili. In una subunità troviamo il sito
regolatore che può essere nella configurazione attivata oppure in quella
inattivata. Se il modulatore induce una attivazione della catena metabolica
allora esso si lega al sito regolatore dell’enzima stimolando il sito
attivo, situato generalmente in altra subunità, a legarsi col substrato. Al
contrario, se il modulatore è un inibitore, si avrà la perdita di affinità
sul sito attivo dell’enzima. Tale condizione determina il blocco della via
metabolica.
Inibizione allostrerica
In alcuni sistemi
multienzimatici l'enzima regolatore viene inibito in modo specifico dal
prodotto finale della via, quando tale prodotto si accumula oltre le
necessità delle cellule.
In genere l'enzima
allosterico è il primo della via metabolica.
Questa inibizione si chiama inibizione retroattiva o inibizione da
prodotto (meccanismo a feedback).
Nei batteri è attiva una
via metabolica che converte, attraverso cinque reazioni, un aminoacido, la
L-treonina in un altro aminoacido, la isoleucina. Il primo enzima di questa
via metabolica è la treonina deidratasi (E1) e viene inibito
allostericamente, con meccanismo a feedback , dalla isoleucina.
È ovvio che quando la
Isoleucina, che funziona da effettore o modulatore, viene utilizzata dalla
cellula e la sua concentrazione diminuisce, essa si stacca dall’enzima
allosterico che ritorna nella conformazione attivata e il sito attivo
ritorna affine alla L-Treonina e la via metabolica riprende la sua attività.
La cinetica enzimatica, con gli enzimi allosterici, ci fornisce curve di
velocità con andamento sigmoide e non iperbolico. Il valore della Vmax
non cambia mentre cambia quello della Km che diminuisce
in caso di effettore positivo ed aumenta in caso di effettore negativo.
Altri
meccanismi di regolazione enzimatica si hanno
quando l’enzima viene modificato covalentemente da alcuni gruppi chimici
come il fosfato, l’adenosina monofosfato, l’uridina monofosfato e i gruppi
metilici. Questi gruppi possono legarsi all’enzima ed essere rimossi da
altri enzimi. Un enzima appartenente a questa categoria è la glicogeno
fosforilasi che regola nel muscolo e nel fegato il processo di
demolizione del glicogeno.
Un esempio
interessante del meccanismo di regolazione enzimatica è dato da due
effettori importanti come la calmodulina, in tutte le cellule, e la
troponina nelle cellule muscolari.
Essi sono attivati,
all’interno delle cellule, dalla presenza di ioni Ca2+ che è
normalmente bassa rispetto a quella dell’ambiente extracellulare con un
gradiente di circa 10.000 volte. La cellula, in condizioni normali, non fa
passare gli ioni Ca, opponendosi alla naturale tendenza mantenendo chiusi
i canali proteici. Sappiamo che la contrazione muscolare avviene quando la
cellula apre i canali proteici agli ioni Ca2+ ; in queste
condizioni la troponina viene attivata, altrimenti, vista la bassa
concentrazione degli ioni Ca, essa è una molecola inattiva.
Un segnale nervoso fa
aprire i canali proteici, gli ioni Ca2+ passano attraverso la
membrana e si legano alla troponina che viene così attivata. La troponina,
funziona da effettore attivando un enzima che determina la contrazione
muscolare. In questo meccanismo è interessante notare la connessione
che c’è tra un segnale nervoso e la sua “traduzione” in attività
chimica precisa.
La concentrazione
degli enzimi allosterici è generalmente molto bassa nelle cellule e la
loro sintesi viene stimolata o inibita da specifici ormoni che operano a
livello genico.
L’insulina, ad esempio
esplica la sua azione stimolando la sintesi degli enzimi glucochinasi,
fosfofruttochinasi e glicogeno sintetasi, reprimendo quella degli enzimi
della biosintesi del glucosio, rispettando il suo effetto
ipoglicemizzante.
È interessante
osservare che le vie anaboliche e quelle cataboliche sono sempre
localizzate in organelli e compartimenti cellulari diversi in modo che gli
enzimi che controllano una via catabolica, non controllino
contemporaneamente anche quella anabolica.
La
compartimentazione è un metodo efficiente della gestione dell’attività
cellulare.
Il
grafico mostra l' effetto dell'aumento della concentrazione di substrato
sulla velocità iniziale di una reazione catalizzata da un enzima. 
e
in caso di effettore positivo ed aumenta in caso di effettore negativo.